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          科研成果

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          大鯢肉酶解產物的制備及其抗氧化性的研究

          摘要:以大鯢肉為原料,利用Aspergillus sp.酸性蛋白酶進行酶解,研究其最佳的酶解條件以及酶解產物的抗氧化怍用。結果表明,大鯢肉酶解的最佳工藝條件為Aspergillussp.酸性蛋白酶加酶量為0.4(質量比)及底物濃度為0.1g/mL時,酶解時聞5.5h,pH2.0,溫度45℃。時間飛行質譜表明酶解產物的分子量小于2000,苯酚硫酸法測定糖含量為2,Fo1in一酚試劑法測蛋白含量為93。大鯢酶解產物清除羥基自由基(·OH)和DPPH自由基的能力隨濃度升高而增強。

          關鍵詞:大鯢肉;酸性蛋白酶;抗氧化活性

          大鯢是世界上現存最大的也是最珍貴的兩棲動物。它的叫聲很像幼兒哭聲,因此人們又叫它“娃娃魚”,是國家二類保護水生野生動物,是農業產業化和特色農業重點開發品種。由于大鯢具有較高的營養和藥用價值,被視為珍品。大鯢肉中蛋白含量豐富,氨基酸組成全面,符合人體需要量模式,且呈味氨基酸含量和比例都較高,味道鮮美。

          本文以大鯢肉為原料,利用酸性蛋白酶進行酶解,對其酶解產物進行抗氧化活性試驗,發現其具有較強的抗氧化作用。

          1 材料與方法

          1.1材料

          大鯢肉,2010年10月由張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司提供。

          Aspergillus sp.酸性蛋白酶由大連海洋大學·張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司生物技術聯合實驗室制備。其它試劑均為國產分析純試劑。

          1.2方法

          1.2.1大鯢肉酶解液的制備取新鮮的大鯢肉,洗凈后用組織搗碎機研磨成糜狀物,加入一定量的水,攪拌均勻后加入酸性蛋白酶,改變酶解溫度、pH、加酶量和酶解時問等閑素,測定酶解產物的肽得率。

          1.2.2蛋白質含量和酶解液肽含量的測定蛋白含量采用Folin一酚法測定;采用三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白后,采用Folin一酚法測定酶解液的肽含量。

          1.2.3糖含量的測定采用三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白后,用苯酚一硫酸法測定樣品中糖含量。

          1.2.4大鯢肉酶解產物分子量的測定大鯢肉酶解液凍于后的產物用5~1OL0.15三氟乙酸(TFA)溶解后離心,取離心后的上清液與等體積的基質混合點靶進行時問飛行質譜(MALDI—TOF)測定。質譜測定的條件:N激光源,波長337nm,正離子線性方式檢測(飛行管長1.6m,加速電壓為25kV)?;|:芥子酸(SA),用0.1TFA/5O的乙腈配成飽和溶液,再將該溶液與0.1TFA/50的乙腈以1:1的比例混合。

          1.2.5清除羥基自由基(·OH)能力的測定
          分別取酶解液2mL,加人1mL9mmol/L的Fe—SO,9mmol/I的水楊酸一乙醇2mL,混勻后加入質量分數為7.5的雙氧水2mL啟動反應,在37℃水浴保溫30min,以蒸餾水作為空對照,于510nm下測吸光度,考慮到樣品本身的吸光度以9mmol/I的FeSO41mL,9mmol/L的水楊酸乙醇2mI,不同濃度的酶解液2mI為本底吸收‘。清除率計算公式如下:.OH清除率/%一一(A^一A)/×100式中,A。為空白對照的吸光度值;A為加入樣液的吸光度值;A如為不加H0。的樣液的吸光度值。

          1.2.6清除DPPH自由基能力的測定用無水乙醇配制2.0×10raol/L的DPPH溶液,于棕色瓶中低溫避光保存備用。分別取2mL酶解液于試管中,加入2mL所配制的DPPH溶液,混合均勻,在25℃水浴中反應30min,移人lcm比色管中,于517nm處測定其吸光度值Ai,同時測定2mL樣液加2mL無水乙醇25℃水浴中反應3Orain后的吸光度值Aj,以及2mLDPPH加2mL蒸餾水25℃水浴中反應30min后的吸光度值A。,酶解液對DPPH的清除率按下式計算:清除率/一Ao一(A;一A)/A。×100式中,為試劑空白的吸光值;A為樣液的吸光值;Aj為樣液本底的吸光值。

          2 結果與討論

          2.1酶解大鯢肉制備低聚肽單因素條件的影響

          2.1.1酶解溫度對大鯢肉酶解的影響將酶解條件設定為:pH值2.0,加酶量為0.5(質量比),于4O、45、50、55、60℃下分別酶解4.5h,底物濃度為0.1g/mL,測肽得率如圖1所示。由圖1可知,當酶解溫度在40~6O℃之間變化時,隨著酶解溫度繼續上升,肽得率逐漸升高,當溫度達到55℃,肽得率達到最大值后,再繼續提高酶解溫度,所得的肽得率出現下降的趨勢。溫度過高,可以使酶變性甚至失活。但當溫度達到45℃后,肽得率變化不是很大,考慮到成本等問題,所以,確定大鯢肉酶解反應的最適溫度為45℃。

          2.1.2 酶解時間對大鯢肉酶解的影響將酶解
          條件設定為:pH值2.0,加酶量為0.5(質量比),于45℃下分別酶解1.5、3、4、5、6h,底物濃度為0.1g/mL。測定肽得率如圖2所示。由圖2可知,當酶解時間在3~5h之間變化時,隨著酶解時間的增大肽得率不斷增加,但在5h后上升幅度趨于平緩,故確定 酶解 時間為5h最佳 。

          2.1.3 pH值對大鯢肉酶解的影響將酶解條件設定為:pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,加酶量為0.5(質量比),于45℃下酶解5h,底物濃度為0.1g/mL。測定肽得率如圖3所示。由圖3可知,隨著pH的不斷升高,肽得率出現下降趨勢,所以,大鯢肉酶解液反應的最適pH為2.0。

          2.1.4 酶加量對大鯢肉酶解的影響將酶解條件設定為:pH值2.0,加酶量為0.29,6、0.39,6、0.4、0.5、0.6(質量比),于45℃下分別酶解5h,底物濃度為0.1g/mL。測定肽得率如圖4所示。由圖4可知,當加酶量不斷增加時,肽得率不斷上升,當酶加量大于0.3時,肽得率上升幅度平穩,綜合成本和肽得率兩方面考慮,確定酶加量為0.4(質量比)。

          2.1.5 最佳酶解條件的確定影響酶解反應的幾個主要因素為酸性蛋白酶的加酶量、酶解時間、pH和酶解溫度。根據上述單因素試驗分析,并考慮生產成本等因素,以所得肽得率為指標做酶加量,酶解時間,pH和溫度4因素3水平的正交試驗L9(34),正交試驗的因素水平見表1,正交試驗結果見表2。

          由表2可知,各因素對酶解大鯢肉制備低聚糖肽影響的大小順序為B>C>D>A,即酶解溫度>酶解時問>加酶量>pH。各個因素的影響頃序為BC。D。A,由表2可以看出,BCDA。

          肽得率最高,因為pH值的影響不是最明顯的,所以最優水平為B。C。D2A,即pH為2.0,酶解溫度為45℃,酶解是間為5.5h。加酶量為0.4(質量比)。

          2.2 大鯢肉酶解產物分子量的測定

          圖5的飛行質譜表明酸性蛋白酶酶解大鯢肉獲得的產物,確定為低聚肽,核質比在小于2000的區域。m/z主要有948.365、1020.105、1150.219、1262.864、1435.411、1830.835。

          2.3大鯢肉酶解液抗氧化性的研究2.3.1清除羥基自由基(·OH)能力測定準確稱取凍干后的酶解產物,將其配成2mg/mL的溶液,分別取0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.0mL上述溶液,按1.2.5的方法測定其清除羥基自由基能力,結果如圖6。

          隨著酶解液濃度的增加,羥基自由基(·OH)的清除率達到86左右就趨于平緩增加狀態,一直增加到89左右,清除率不再增大,故大鯢酶解液肽粉的濃度達到2mg/mL,清除羥基自由基(·OH)能力達到最大。

          2.3.2清除DPPH自由基能力的測定準確稱

          取凍干后的酶解產物,將其配成2mg/mL,分別取0.6mL、0.8mL、1.01TIL、1.2mL、1.4mI上述溶液,加蒸餾水至2mL,按1.2.6的方法測定其清除DPPH自由基能力,結果如圖7。

          隨著酶解產物濃度的增加,DPPH的活性清除率達到80%左右就趨于平緩狀態,故大鯢酶解液肽粉的濃度達到1.2mg/mL,DPPH清除率達到最大。

          3 結論

          由試驗結果可知,酸性蛋白酶水解大鯢肉的最適條件為pH為2.0,酶解溫度45℃,酶解是問5.5h,加酶量0.4%(質量比)。酶解產物具有清除羥基自由基和DPPH自由基的能力,測定結果表明當大鯢肉酶解液低聚肽的濃度達到2mg/mL,清除羥基自由基(·OH)能力達到最大,當濃度達到1.2mg/mL時,DPPH清除率達到最大。

           

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