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          科研成果

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          大鯢胃蛋白酶分離純化及其性質的研究

          摘要:通過研究大鯢胃蛋白酶,可以了解大鯢消化機能,同時為食品加工提供新的材料。經80%硫酸銨沉淀、DEAE52離子交換層析、SephadexG-100凝膠過濾層析以及HPLC,得到大鯢胃蛋白酶電泳純制品。純化倍數為239.87,回收率為4.4%,經SDS-PAGE測得該胃蛋白酶分子量為31ku,大鯢胃蛋白酶的最適溫度是40℃,低于40℃穩定,當溫度上升,活性迅速下降;最適pH為2,在pH2~6有很好的穩定性。EDTA、BrAc、NBS使該酶活性下降。以酪蛋白為底物,在pH2.0、40℃時測得米氏常數Km值為7.3×103mg/L,Vmax是2.674μg/min。
          關鍵詞:大鯢,胃蛋白酶,純化,性質

          中國大鯢(AndriasdavidianusBlanchard),它的叫聲像幼兒哭聲,因此人們又叫它“娃娃魚”。屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科,是我國特有的大型珍稀兩棲動物。主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游的溪流中。大鯢的消化功能十分強大,有很強的耐饑本領,甚至二、三年不吃也不會餓死;它同時也能暴食,飽餐一頓可增加體重的五分之一。隨著人工養殖技術的發展,大鯢的開發利用受到越來越多的關注。由于大鯢肉味鮮美,營養價值高,所以逐漸成為餐桌上的美味佳肴,而內臟則被丟棄。本實驗通過對大鯢胃蛋白酶的相關研究為大鯢內臟的合理回收利用提供理論基礎。

          1 材料與方法

          1.1 材料與儀器

          大鯢胃2011年10月由張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司提供;CelluloseDE-52、SephadexG-100Sigma公司;牛血清蛋白北京奧博星生物技術有限責任公司。核酸蛋白檢測儀上??等A生化儀器制造有限公司;XWT-S系列小型臺式記錄儀上海自動化儀表股份有限公司;FD-1冷凍干燥機上海博通經貿有限公司;高效液相色譜儀大連伊利特分析儀器有限公司;UV-754型紫外可見分光光度計上海第三分析儀器廠;GL-21M高速冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司。

          1.2 實驗方法

          1.2.1 粗酶液的制備將大鯢內臟用蒸餾水洗凈,濾紙吸去水分稱重,先用剪刀剪碎再用組織搗碎機搗碎,按1∶5的比例加入磷酸緩沖液(pH7.4,0.01mol/L),浸泡4h。離心(9000r/min,4℃)30min取上清液,去沉淀,量筒量體積。用80%硫酸銨沉淀,置于冰箱過夜(4℃)。離心(9000r/min,4℃)30min去上清,收集沉淀,2~3mL磷酸緩沖液溶解沉淀,透析,得到粗酶液。

          1.2.2 DEAE-52陰離子交換層析DEAE-52陰離子交換層析柱按產品說明書要求進行處理,裝柱(2.5cm×13cm)后,用4倍柱床體積(200mL)的蒸餾水平衡,上樣量為4mL。用1mol/LNaCl溶液進行線性梯度洗脫,流速為2mL/min,3mL/管,紫外檢測波長為280nm。測定各管的紫外吸收值和酶活力。收集酶活性較高的各管酶液,透析、冷凍干燥,進行下一步純化。

          1.2.3 SephadexG-100凝膠過濾層析SephadexG-100凝膠過濾層析柱按產品說明書要求進行處理,裝柱(2.5cm×100cm)后,用KCl-HCl緩沖液(pH2,0.01mol/L)平衡柱床,上樣量為10mL。用上述緩沖液進行洗脫,流速為3mL/min,3mL/管,紫外檢測波長為280nm。測定各管的紫外吸收值和酶活力。收集酶活性較高的各管酶液,透析、冷凍干燥,進行下一步純化。

          1.2.4 HPLC色譜層析將SephadexG-100凝膠過濾層析收集得到的活性組分溶于檸檬酸酸緩沖液(Na2HPO4-檸檬酸,0.2mol/L,pH4.0)中,用0.45μm的微孔濾膜過濾。取20μL上樣進行純化。色譜柱:TSK凝膠色譜柱G4000PWXL(4.6mm×300mm),柱溫為室溫,流動相為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.2mol/L,pH4.0);280nm下紫外檢測。按酶活力測定方法測定,透析,冷凍干燥,得到蛋白酶純品。

          1.2.5 胃蛋白酶活力的測定采用分光光度法,對其稍作修改:取1%酪蛋白1mL加3.9mLKCl-HCl緩沖液(pH2.0,0.01mol/L)于40℃恒溫水浴預熱5min,加入胃蛋白酶液0.1mL反應30min,加入0.5mL10%TCA(三氯乙酸)終止反應。離心(9000r/min,10min),取上清測OD280。對照樣是1mL,1%酪蛋白加4mL同樣的緩沖液,40℃恒溫水浴預熱5min,不加酶液,反應30min,加入0.5mL10%TCA(三氯乙酸)終止反應。離心(9000r/min,10min)。蛋白酶活力單位為:1mL酶液,在此條件下,每分鐘增加0.001個OD值為一個酶活力單位,以U/mL表示。

          1.2.6 蛋白質含量測定按Lowry法進行測定,以牛血清白蛋白為標準樣品。

          1.2.7 胃蛋白酶相對分子量的測定用SDS-PAGE測定其分子量。

          1.2.8 溫度和pH對酶活力及其穩定性的影響取0.1mL酶液分別在5~60℃反應,按酶活力測定方法測其OD280。確定其最適溫度。0.1mL酶液分別在5~60℃保溫30min后,在40℃反應30min,加入TCA終止反應。測OD280,以觀察溫度對酶活力穩定性的影響。取0.1mL酶液分別在pH1~6的緩沖液中反應,按酶活力測定方法測其OD280,pH1~2是KCl-HCl緩沖液,pH3是Na2HPO4-檸檬酸緩沖液,pH4~5是HAc-NaAc緩沖液,pH6是Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。確定其最適pH。0.1mL酶液分別在pH1~6的緩沖液中保溫30min后,在40℃反應30min,加入TCA終止反應。測OD280,以觀察pH對酶活力穩定性的影響。

          1.2.9 胃蛋白酶的動力學測定分別配制不同質量濃度1.0×104、5.0×103、2.5×103、1.66×103、1.25×103、1.0×103、8.3×102、7.14×102mg/L的酪蛋白為底物,在40℃,pH2的條件下按酶活力測定方法測其OD280。用雙倒數作圖法作圖。

          1.2.10 金屬離子、EDTA和化學試劑對蛋白酶活力影響測定在緩沖液中分別加入5、10mmol/L的Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+、Li+、Mn2+、EDTA,以及0~100μmol/L的BrAc和0~10μmol/LNBS抑制劑。按測酶活力的方法測其OD280,觀察金屬離子,EDTA和化學試劑對蛋白酶活力的影響。

          2 結果與分析

          2.1 胃蛋白酶的分離純化粗酶液經DEAE-52離子交換層析,NaCl梯度洗脫,得到層析液,測OD280,結果如圖1所示,有兩個蛋白峰。對其進行酶活力檢測,第二個蛋白峰有酶活力,收集樣品并透析,凍干。之后經過SephadexG-100凝膠過濾層析,對每一個層析管測定OD280,結果如圖2所示,有兩個蛋白峰。對其進行酶活力檢測,都有蛋白酶活力,且第二個蛋白峰的活力大于第一個蛋白峰。收集第二個蛋白峰,透析,冷凍干燥。

          將得到的樣品用高效液相 TSK 凝膠色譜住 ( G4000PWXL) 進行純化。結果如圖3 所示,所得到的 蛋白峰為單一對稱層析峰,這表明所提取的蛋白較 純。采用酶活力檢測方法檢測到該蛋白峰有活力, 收集此峰,透析并凍干。經 SDS-PAGE 電泳,顯示為 一條蛋白帶,說明該蛋白酶樣品已經達到電泳純,整個酶的分離純化結果如表 1。

          2.2 胃蛋白酶相對分子量

          通過 SDS-PAGE 對經 HPLC 后收集的胃蛋白酶 分子量進行測定。所得結果如圖 4 所示,加入 β-巰 基乙醇和不加入 β-巰基乙醇的情況下均表現為一 相對分子量為 31ku( 數據未在圖上顯示) 。β-巰基 乙醇可以打開-S-S-連接的蛋白質亞基,所以大鯢 胃蛋白酶不含有-S-S-連接的亞基。

          2.3 溫度和 pH 對酶活力及其穩定性的影響

          測定在 5~60℃范圍內溫度對酶活力及其穩定性 的影響,以反應條件為 pH2, 40℃ 下測得的活性為100% 。結果如圖 5 所示,溫度在 20~40℃活性較高, 最適溫度是 40℃; 在 5~40℃ 酶活力相對穩定,高于 40℃酶活力開始下降, 60℃時相對酶活性少于 20% 。

          在 pH1~6 時測定 pH 對酶活力及其穩定性的影 響,以反應條件為 pH2, 40℃下測得的活性為100% 。 結果如圖 6 所示, pH 在 2 時活性最高,是最適 pH。 在 pH2 ~ 6 時酶活力相對穩定, pH1,酶活力下降 為 60% 。

          2.4 胃蛋白酶的動力學

          通過測定不同底物濃度下的反應速度,可以確 定酶催化反應的最大速度 Vmax和米氏常數 Km。采用 雙倒數作圖法( Lineweaver-Burk 法) ,以 1 /V 為縱坐 標, 1 /[S]為橫坐標作圖。如圖 7 所示,分別得出最 大反應速度 Vmax和米氏常數 Km。Vmax =2.674μg/min, Km =7.3 ×103mg/L。

           

           

          2.5 金屬離子、 EDTA 和化學試劑對蛋白酶活力影響測定

          分別研究不同濃度的 Ca2 + 、 Zn2 + 、 Cu2 + 、Mg2 + 、 Ba2 + 、 Li + 、 Mn2 + 、 EDTA 以及化學試劑對蛋白酶活力 的影響。

          測定不同濃度金屬離子對酶活力的影響,結果 如表 2 所示, Li + 對酶有輕微的抑制作用, Mn2 + 、 Ca2 + 、 Zn2 + 、 Mg2 + 、 Ba2 + 、 Cu2 + 對酶活力無影響。EDTA 對酶 活力有很強的抑制作用。 如圖 8 ~ 圖 9 所示,BrAc 的濃度范圍為 0 ~ 80μmol/L 時,酶活力緩慢下降,當 濃 度 達 到 100μmol/L 時,酶活性僅剩 9.6%; NBS 濃度大于 8μmol/L 時,酶活性急劇下降。

          3 討論與結論

          3.1從大鯢胃中提取的胃蛋白酶經四個步驟完成分離純化。粗酶液經鹽析法(飽和度80%的(NH4)2SO4沉淀)獲得粗蛋白,將粗蛋白經過DEAE-52離子交換層析及SephadexG-100凝膠過濾層析得到胃蛋白酶,總活力為79.06U,比活力為247.07U/mg,回收率為4.4%,純化倍數為239.87。將胃蛋白酶經HPLC進一步純化,收集到的樣品經SDS-PAGE凝膠電泳測定胃蛋白酶分子量約為31ku。在童耕雷所說的胃蛋白酶相對分子量31~36ku的范圍內。

          3.2胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶,在酸性環境中,它的穩定性較好,它的最適pH是2,與王璋主著作中所講的相一致。本實驗中大鯢胃蛋白酶的最適溫度是40℃,與吳燕燕等的羅非魚腸蛋白酶和李大志等的蝦夷馬糞海膽蛋白酶的最適溫度相似。

          3.3在pH2,40℃,大鯢胃蛋白酶的Km為7.3×103mg/L,Vmax為2.674μg/min,Km偏大,與底物的親和力不強??赡艽篥F的主要食物來源中酪蛋白含量較少。EDTA對大鯢胃蛋白酶有很強的抑制作用,表明大鯢胃蛋白酶有可能是金屬蛋白酶。Sitthipong等研究的金槍魚中,EDTA對金槍魚的胃蛋白酶影響不大。

          3.4NBS能較專一的修飾蛋白質的色氨酸殘基(Trp)。用不同濃度的NBS對酶進行化學修飾,得知在NBS的濃度為2~8μmol/L時,酶活力不受影響,當濃度為10μmol/L時,酶活性急劇下降??梢?,大鯢胃蛋白酶酶活性中心基團含有色氨酸。BrAc能較專一的修飾蛋白質的組氨酸殘基。當BrAc的濃度范圍為20~80μmol/L時,酶活力緩慢下降,當濃度為100μmol/L時,酶活性剩余9.6%,幾乎失活。說明組氨酸是酶活性必需基團之一。通過上述這些研究,得到了一些大鯢胃蛋白酶的性質,但還不足以解釋大鯢具有耐饑本領的原因,還需要日后深入研究

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