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          科研成果

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          大鯢皮膠原蛋白肽的結構特性及其對乙醇誘導肝損傷小鼠的保護作用

          摘要:研究了大鯢皮膠原蛋白肽結構特性及其對乙醇誘導肝損傷小鼠的保護作用。大鯢皮經胃蛋白酶水解制備膠原蛋白,經木瓜蛋白酶水解制備大鯢皮膠原蛋白肽。紫外光譜及紅外光譜結果表明,大鯢皮膠原蛋白肽具有膠原蛋白的三股螺旋結構。SDS-PAGE結果表明大鯢皮股原蛋白肽分子量低于55ku。大鯢皮膠原蛋白肽低(50mg/(kg•d)、高(150mg/(kg.d))劑量組可顯著抑制小鼠乙醇誘導產生的血清中AST、AI,T活性的升高,顯著抑制肝組織MI)A含量升高,并且抑制肝組織中SOD活性的下降。組織病理表明,乙醇誘導肝損傷模型組小鼠肝細胞明顯腫脹變形,肝細胞索紊亂,伴有炎癥細胞侵潤,大鯢皮膠原蛋白肽各劑量組的肝細胞排列規則、肝細胞索清晰。結果表明,大鯢皮股原蛋白肽具有保護乙醇誘導小鼠肝損傷的作用。

          關鍵詞:大鯢,皮膚,膠原蛋白肽,乙醇,肝損傷

          酒精性肝損傷足一種較為普遍的世界性疾病。 酒精對人體各個系統如:血液系統、消化系統、中樞神經和心血鈐系統等產生不同程度的臟器損傷。急性酒精忡肝損傷足由于機體短吋叫攝入大量的乙醇,經機體氧化代謝產生乙醛對肝臟組織的脂肪代謝造成影響造成的。同吋,機體乙醇代謝大量產生的氧自由基等自由基,造成肝臟細胞膜的脂質過氧化,導致損傷肝組織,進而嚴重影響肝臟蛋白質、碳水化合物等物質代謝。針對這一問題,人們致力于從天然食物和藥物中尋找對酒精肝損傷具侖保護作用的活性物質。玉米肽、靈芝肽、牛蒡菊糖等相繼被報道其對酒精性肝損傷具有保護作用。這些結果表明,肽類、多糖類物質足對灑精肝損傷具侖保護作用活性物質的潛在來源。

          大鯢(Andrias davidianus)為國家二級保護動物。自1999年農業部將大鯢列為重點開發的養殖品種以來,大鯢人工繁育、養殖技術獲得了重大突破。2012年大鯢養殖量已經突破330萬尾。因此,對于大鯢的精深加工成為目前的一個緊迫任務。目前,未見大鯢膠原蛋白肽肝保護作用的研究。本文研究大鯢加工副產物大鯢皮制備的膠原蛋白肽對乙醇誘導肝損傷小鼠的影響,探討大鯢皮膠原蛋白肽對乙醇誘導肝損傷小鼠的保護作用,以期為大鯢產業化副產物的利用提供一定的依椐。

          1 材料與方法

          1.1材料與儀器

          大鯢皮 張家界(中國)金馳大鯢牛物科技有限公司;清潔級昆明種小鼠(體質量18~22g,雌雄各半)人連醫科大學實驗動物研究中心[SCXK(遼)2008-00021];胃蛋白酶(10OOOU/g)、木瓜蛋白酶(500000U/g)、SDS(AR)、β-巰基乙醇、溴酚藍 北京索萊寶科技有限公司;谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒以及考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;硫普羅寧 河南竹新誼藥業股份有限公司。

          BS110S分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;GI,-21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機;TU-1810紫外吋見光光度計 上海光譜儀器有限公司;85-1電磁攪拌器金壇市醫療儀器;FD-1冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

          1.2 實驗方法

          1.2.1 酶法提取大鯢皮膠原蛋白參照文獻的方法:將大鯢皮解凍,去除皮下脂肪,剪成5mmx5mm小塊,加入5%NaCl水溶液浸泡24h,除去非膠原蛋白成分。蒸餾水洗滌兩次,加入0.5mol/L乙酸溶液(料液比1:20)以及加入勻漿液0.5%的胃蛋內酶,4ºC:溶脹12h。溶脹后的人鯢皮,組織搗碎,得到人鯢皮勻漿。勻漿液4ºC磁力攪拌提取36h。過濾,濾液9000r/min,離心30min。上清液為大鯢皮酸溶性膠原蛋白粗溶液。上清液中加入NaCl,至NaCl最終溶液濃度為0.9mol/L,過夜,離心收集沉淀。沉淀溶于0.5mol/L乙酸溶液,先用Na2HPO4透析液透析2d,再用蒸餾水透析2d。凍干得大鯢皮酸溶性膠原蛋白。

          1.2.2 人鯢皮膠原蛋白肽制備人鯢皮膠原蛋白濃度30mg/mL,pH調至6.5,加入0.1%木瓜蛋白酶,水浴溫度45ºC:反應4h。反應結束后,大鯢皮膠原蛋白酶解液100ºC,加熱10min滅酶。過濾,濾液冷凍干燥得大鯢皮膠原蛋白肽樣品。

          1.2.3 SDS-PAGE電泳根據Laemmli的方法,分制備10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定大鯢皮膠原蛋白與大鯢皮膠原蛋白肽。

          1.2.4 大鯢皮膠原蛋白、大鯢皮膠原蛋白肽紫外光譜測定 提取的大鯢皮膠原蛋白及膠原蛋門肽樣品溶于0.5mol/L乙酸溶液,配制lg/L溶液。10000r/min,離心30min?測上清液200~4000nm紫外吸收光譜。

          1.2.5大鯢皮膠原蛋白肽紅外光譜測定將樣品與KBr壓制成片,掃描500~4000cm波長范圍的光譜吸收值。

          1.2.6 肝損傷小鼠及給藥 選昆叨種小鼠50只,隨機分成空白對照組、模型對照組和硫普羅寧陽性對照組(50mg/kg.d),大鯢皮膠原蛋白肽低濃度(50mg/kg.d)、高濃度(150mg/kg.d)劑量組,每組10只,于12h黑暗,12h光亮的塑料飼養箱內飼養,室溫(20±2) ºC,濕度40%~60%,自由采食和飲水。各給藥組每天灌胃1次,連續2周。對照組和模型組給予同樣量的生理鹽水,于每次給藥3h后,除空白對照組外,各組均灌胃56度商品二鍋頭16mL/(kg.d)。各組均于末次給藥后禁食不禁水。

          乙醇肝損傷小鼠于末次給藥16h后,斷頭取血,在30min內,3500r/min,離心5min后得上層血清備用。

          快速處死小鼠取肝臟,并在肝左葉組織取約0.3g放冰冷的生理鹽水中漂洗,取出后用濾紙將水吸干,制成10%肝組織勻漿液(生理鹽水的休積總量是組織塊體積的9倍),制備好的10%的肝組織勻漿液在低溫低速離心機中以2000r/min左右離心10~15min,將離心好的勻漿保留上清液棄沉淀待測。

          1.2.7 生化指標檢測與病理學觀察 血清屮谷草轉氨酶(AST)與谷丙轉氨酶(ALT)活性,肝臟組織中丙二醛(MDA)含量,超氧化物岐化酶(SOD)活性,蛋白質含量均按試劑盒的要求進行測定。處死小鼠后,取肝臟右葉組織約0.3g,用10%的屮性甲醛溶液進行固定,石蠟包埋切片。蘇木精-伊紅(HE)染色,在顯微鏡下進行病理學觀察。

          1.2.8 統計學處理用SPSS統計軟件對實驗數據進行處理,數值以表示。

          2 結果與分析
          2.1 大鯢皮膠原蛋白肽結構特性
            由圖1可見,所提取的大鯢皮膠原蛋白具有α1、α2和β組分,屬于典型的I型膠原蛋白。大鯢膠原蛋白分子量大于lOOku。大鯢皮膠原蛋白經木瓜蛋白酶酶解,獲得的大覲膠原蛋白肽分子量低于55ku。

          通過紫外光譜研究發現,大鯢皮膠原蛋白和膠原蛋白肽均在234nm處出現特征吸收峰(圖2)。這表明大鯢皮膠原蛋白和膠原蛋白肽具有近紫外肽鍵C=O中的電子n->π*躍遷叫提取的膠原蛋白和膠原蛋白肽具有和似的紫外吸收光譜,說明木瓜蛋白酚酚解大鯢皮膠原蛋白時沒有破壞其中具有紫外吸收特征的結構,即大鯢皮膠原蛋白肽仍然符合膠原蛋白的紫外吸收基本特征。

          大鯢皮膠原蛋白及膠原蛋白肽紅外光譜如圖3所示。大鯢皮膠原蛋白(圖3A)和大鯢皮膠原蛋白肽(圖3B)分別在3320.81,3292.61cm-¹處具有吸收峰,表明分子中N-H參與氫鍵締合;在3081.73和3080.55-¹處是酰胺B帶C-N伸縮振動產牛的吸收峰;在2929.34、2961.86cm-¹處吸收峰由于酰胺B存在CH2;在1653.26. 1655.44cm-¹處有強峰由于酰胺I帶的C-O伸縮振動產生的;在1540.66、1548.25cm-¹處具有吸收峰,是由于酰胺II帶存在的N-H彎曲振動產生的吸收,與膠原蛋白酰胺II在1500~1600cm-¹有C-N伸縮振動以及N-H彎曲振動產生的吸收峰,本質為α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲疊加形成吸收帶,同時Arg, Asp, Glu和Tyr側鏈在此區域也有吸收。大鯢皮膠原蛋白(圖3A)和大鯢皮膠原蛋白肽(圖3B)在1451.56和1451.63cm-¹處由于存在CH2彎汕產生吸收;在1238.29和1245.60cm¹處存在酰胺III的N-H以及N-H變形出現的吸收峰;在1079.28和1083.15cm-¹處吸收峰是由于C-O, C-N-C振動產牛的;在1653.26和1655.44cm-1處出現三股螺旋內部形成氫鍵的C=O振動產牛的吸收峰;在1238.29和1245.60cm-1處的吸收是由于甘氨酸及矩脯氨酸形成特有的Gly-Pro-Hyp氨基酸序列出現的紅外特征光。

          由此可見,提取的大鯢皮膠原蛋白和大鯢皮膠原蛋白肽均具有三股螺旋結構。胃蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解沒有破壞膠原蛋白中具有的三股螺旋結構,但膠原蛋白肽的分子量明顯變小,說明酶解過程是橫向水解大鯢皮膠原蛋白。大鯢皮膠原蛋白肽是具有三股螺旋結構的小分子膠原蛋白分子。這對其具有更好的溶解性及牛物活性具有重要作用。

          2.2大鯢皮膠原蛋白肽對乙醇誘導肝損傷小鼠的影響

          昆明種小鼠經過每天灌胃大鯢皮膠原蛋白肽,連續2周后斷頭取血分析其生物化學指標,以確定其對乙醇誘導肝損傷小鼠的影響。結果如表1所示,飼喂大鯢皮膠原蛋白肽組的ALT、AST明顯小于乙醉模型組(P<0.01)。大鯢皮膠原蛋白肽低劑量及高劑量組與乙醇模型組肝組織中MDA含量相比顯著下降(p<0.01)。大鯢皮膠原蛋白肽低劑量:及高劑量組SOD含就均高于乙醉模型組肝紐織中的SOD含量。

          各實驗組的肝臟組織病理變化如圖4所示。對照正常的肝紐織切片,乙醉模型組肝細胞出現腫脹,出現大小不等的脂肪滴,伴有炎癥細胞浸潤;硫普羅寧對曲組,基木與正常肝組織一致,肝細胞結構清晰,形態較正常;大鯢膠原蛋白肽低劑量紐肝組織輕微損傷,肝細胞輕微腫脹,脂肪滴空泡較乙醉模型組輕;大鯢膠原蛋白肽高劑量組肝組織細胞正常,肝索排列整齊,與正常肝組織細胞差別不大。牛物化學指標及組織病理結果表明,大鯢膠原蛋白肽具右明顯減輕乙醇對肝組織的急性損傷的作用。

          3 結論

          本研究以大鯢皮為原料制備大鋭皮膠原蛋白肽,經紫外光譜及紅外光譜結果表明,大鯢皮膠原蛋白肽具有膠原蛋白類似的三股螺旋結構。SDS-PAGE。

          結果表明其分子量低于55ku。大鯢皮膠原蛋白肽低、高劑量組顯著抑制乙醇導致小鼠血清中ALT、AST活性升高,減少肝臟氧化產物MDA的產生,抑制乙醇導致的肝臟中SOD活性下降。組織病理表明,大鯢皮膠原蛋白肽低、高劑量組的肝臟細胞排列整齊,肝索清晰,脂肪滴空泡減輕,較乙醇模型組肝損傷顯著減輕。大鯢皮膠原蛋白肽具有減輕酒精誘導小鼠急性肝損傷的作用。

           

           

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