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          科研成果

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          大鯢低聚糖肽安全性的毒理學初步研究

          摘 要: 目的 研究大鯢低聚糖肽的安全性。方法 采用小鼠急性經口毒性實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗和大鼠 30 d 喂養實驗, 評價大鯢低聚糖肽的安全性。結果 雌、雄性小鼠急性經口在 11764.7 mg/kg·BW劑量時, 未見毒性不良反應, 根據急性毒性劑量分級標準, 大鯢低聚糖肽屬于無毒級; 大鯢低聚糖肽無致小鼠骨髓細胞微核效應, 30 d 喂養實驗未見大鼠的生長發育、生物化學指標、臟器/體質量比值比及病理學變化。結論 毒性實驗未見大鯢低聚糖肽產生明顯毒副作用。

          關鍵詞: 大鯢; 低聚糖肽; 毒性; 小鼠; 大鼠

          1 引 言

          大鯢(Andrias davidianus)屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科, 是我國特有的珍稀物種, 屬國家二類保護動物, 主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游的溪流中。20 世紀 90 年代以來, 大鯢的人工養殖技術取得了重大突破。目前, 全國大鯢人工繁殖單位已達 100 余個, 年人工繁育大鯢幼苗達 10 余萬尾, 2015 年大鯢養殖總量已接近600 萬尾。因此, 為了提高大鯢養殖業的經濟效益, 大鯢的精深加工成為十分緊迫的任務。大鯢皮膚表面具有豐富的黏液腺和顆粒腺, 這些腺體能分泌大鯢黏液。Qu等利用 Aspergillus sp.酸性蛋白酶酶解大鯢體表黏液,獲得了分子量小于 3500 Da 的大鯢低聚糖肽。佟長青等利用冷凍濃縮工藝獲得了大鯢低聚糖肽粉。曲敏等利用昆明種小鼠研究了不同劑量的大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能的影響, 發現它對小鼠體液免疫功能具有促進作用。進一步研究發現大鯢低聚糖肽還具有體外抗氧化活性、對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用、抗疲勞作用、保濕作用、抑菌、抗血小板聚集活性以及抗光老化作用。目前, 大鯢低聚糖肽已經成為一種新型的生物活性物質, 在食品、藥品、化妝品以及科學研究中具有廣泛的應用。
          來源于大鯢體表黏液的大鯢低聚糖肽, 并不是傳統的食用材料, 也一直未見其安全性研究報道。本研究根據中華人民共和國《食品安全性毒理學評價程序》設計了大鯢低聚糖肽經口小鼠急性毒性實驗、小鼠骨髓細胞微核效應、大鼠 30 d 喂養實驗。本文對大鯢低聚糖肽的安全性研究, 為大鯢低聚糖肽的開發利用提供了安全性依據。

          2 材料與方法

          2.1 材 料

          大鯢體表黏液由張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司提供。大鯢低聚糖肽按照 Qu 等方法制備。周清潔級 ICR 小鼠, 體質量為 18~22 g, 雌雄各半, 購自大連醫科大學實驗動物研究中心。SD 大鼠, 雌雄各半, 雌性動物初始體重 66~80 g, 雄性動物初始體重 71~89 g, 購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司。實驗動物于 12 h黑暗、12 h 光亮的塑料飼養箱內飼養, 室溫(23±2) ℃, 濕度40%~60%, 自由采食和飲水。動物飼料購自北京華阜康生物科技有限公司, 許可證號 SCXK(京)2016-0011。實驗動物生產許可證號 SCXK(遼)2008-0002, 實驗動物使用許可證號 SYXK(遼)2008-0002。

          2.2 實驗方法

          2.2.1 急性經口毒性實驗

          大鯢低聚糖肽以無菌水配制成 0.1 g/mL。ICR 小鼠 20只, 雌雄各半, 于第一次給藥前禁食 12 h, 不限制飲水。采用灌胃途徑給藥。小鼠按 20 g/kg·BW 給予無菌水配制的大鯢低聚糖肽溶液。24 h 內給藥3次, 每兩次間隔8h。給藥結束后觀察 7 d。實驗結束后全部小鼠脫頸處死, 解剖檢查心、肝、脾、肺、腎的病理變化。

          2.2.2 小鼠骨髓細胞微核效應

          選ICR小鼠50只, 隨機分成5組。設置3個劑量組, 高劑量設置為 10 g/kg·BW, 中劑量設置為 5 g/kg·BW, 低劑量設置為 2.5 g/kg·BW, 按 20 mL/kg·BW 灌胃; 實驗同時設置溶劑對照組、環磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg·BW, 腹腔注射)。采用 30 h 給予受試物法, 即兩次給予受試物間隔 24 h, 末次給予受食物后 6 h, 脫頸處死動物, 制備骨髓標本。
          取胸骨或股骨, 止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻, 常規涂片, 涂片自然干燥后放入甲醇固定5~10 min, 保存或繼續后續染色。固定好的片子放入Giemsa 染色工作液中, 染色 10~15 min, 立即用 pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、晾干。寫好標簽, 陰涼處保存, 或直接鏡檢。閱片采用雙盲法, 計數每只動物 200 個紅細胞中的嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte, PCE), 計算其所占比例; 每只動物觀察計數2000個嗜多染紅細胞中微核細胞數, 微核發生率以千分率計。

          2.2.3 30d 喂養實驗

          取SD大鼠80只, 雌雄各半, 雌性動物初始體重66~80g, 雄性動物初始體重71~89 g。設置3個劑量組, 高劑量設置為 10 g/kg·BW, 中劑量設置為 5 g/kg·BW, 低劑量設置為2.5 g/kg·BW, 按 20 mL/kg·BW灌胃。另設置一個對照組。連續喂養 30d。每天觀察大鼠情況。每周稱大鼠體質量和飼料質量, 計算增重、進食量和食物利用率。實驗結束時對大鼠進行血液學、肝功能指標和肝、脾臟器系數測定, 并進行病理學檢查。

          2.2.4 統計學處理

          用 SPSS 統計軟件對實驗數據進行處理, 數值以(X±SD)表示。P<0.05 為差異顯著。

          3 結果與分析

          3.1 急性經口毒性實驗

          急性毒性實驗結果表明, 大鯢低聚糖肽整個急性毒性實驗過程中小鼠未出現死亡, 未見毒性不良反應。實驗結束時剖檢結果也未見病理變化。為了灌胃, 在滿足流動性前提下, 配制最大藥物濃度 0.1 g/mL。結果顯示大鯢低聚糖肽對 ICR 種雌、雄小鼠的急性經口毒性耐受劑量在11764.7 mg/kg·BW 時, 未見毒性反應。因此, 大鯢低聚糖肽屬于實際無毒級物質。

          3.2 骨髓紅細胞微核實驗

          由表 1 可見, 陽性對照組與溶劑對照組相比有極顯著統計學差異(P<0.01), 陽性對照成立; 大鯢低聚糖肽各劑量 PCE 百分比未少于溶劑對照組的 20%, 表明大鯢低聚糖肽在實驗劑量下無明顯細胞毒性; 大鯢低聚糖肽各劑量組的微核發生率與溶劑對照組相比, 均無統計學差異(P>0.05), 提示大鯢低聚糖肽對小鼠骨髓細胞無致微核作用。

          3.3 30d 喂養實驗

          3個劑量組, 高劑量設置為 10 g/(kg·BW·d), 中劑量設置為 5 g/(kg·BW·d), 低劑量設置為 2.5 g/(kg·BW·d), 相當于人體(60 kg 體重)每天吃 1851.85、925.93、277.78 g。各劑量組大鼠喂養過程中進食、活動均正常, 生長發育良好, 無中毒及死亡現象。實驗結果表明, 大鼠體質量、增重、進食量和食物利用率與陰性對照比較, 差異無統計學意義(P>0.05)(表 2)。各劑量組的血液學指標、功能指標和肝、脾臟器系數 , 差異無統計學意義(P>0.05)(表 3、表 4 與表 5)。解剖及病理檢查, 未見有異常及病理學改變。這表明, 大鯢低聚糖肽對大鼠無損害作用。

          4 結論與討論

          大鯢低聚糖肽通過利用 Aspergillus sp.酸性蛋白酶酶解大鯢體表黏液制得。大鯢低聚糖肽的分子量低于 3.5 kDa, 其成分中總蛋白含量為 80.01%, 總糖含量為 15.15%, 總糖中含有鹽酸氨基葡萄糖最高、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和唾液酸。氨基酸分析結果表明, 大鯢低聚糖肽中所含有 18 種氨基酸, 除色氨酸未測出外, 人體其它 7 種必需氨基酸的含量較高, 其中蘇氨酸(Thr)含量最為豐富, 高達13.1%。同時, 大鯢低聚糖肽具有多種多樣的生物活性。因此, 大鯢低聚糖肽具有在食品、醫藥等領域的潛在的應用價值。

          為了確保大鯢低聚糖肽的食用安全性, 根據中華人民共和國《食品安全性毒理學評價程序》的規定, 考察了大鯢低聚糖肽經口小鼠急性毒性實驗、小鼠骨髓細胞微核效應、大鼠 30 d 喂養實驗。大鯢低聚糖肽經口小鼠急性毒性實驗以及小鼠亞急性毒性實驗表明大鯢低聚糖肽屬于無毒級。小鼠骨髓細胞微核效應、大鼠 30 d 喂養實驗以及解剖及病理檢查均未見異常。因此, 在本研究的劑量范圍內大鯢低聚糖肽毒理學是安全的, 可以進一步開發大鯢低聚糖肽在食品及藥品領域的應用。

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