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          科研成果

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          大鯢糖肽組分的高效液相色譜分析及其抗氧化活性研究

          摘 要 :利用高效液相色譜 方法對大鯢糖肽進行 分析 ,使 用 SinoChrom Cs反相柱 和紫外 可變 波長檢 測器 ,并測 定 大 鯢 糖 肽 的羥 基 自由基 清 除 能 力 。結 果 表 明 :大 鯢 糖 肽 組 分 的最 佳 液 相 色 譜 檢 測 條 件 為 :檢 測 波 長 280nm; 流 動 相 為 V(乙 腈 ):V (甲醇 ) :V(0.1 三 氟 乙 酸 ) 一5:5:90; 流 速 1_0mL/min;進 樣 量 20μL。大 鯢 糖 肽 在 5.78 μg/mL濃度 時 ,羥 基 自由基 的 清 除 率 達 60.19 ,具 有 較 好 的 抗 氧 化 活 性 。 
          關 鍵 詞 :大 鯢 ;糖 肽 ;高 效 液 相 色 譜 ;抗 氧 化 活 性

          大鯢俗稱娃娃魚(Andriasdavidianus),是世界上現存最大的也是最珍貴的兩棲動物。大鯢既是國家二類保護水生野生動物,也是農業產業化和特色農業的重點開發品種,具有較大的開發利用潛力。國外學者對兩棲類動物皮膚分泌物的研究已長達4O多年,報道了500多種活性肽。兩棲類動物皮膚中含有的多種生物活性肽是生物活性肽的重要來源]。作者利用高效液相色譜方法(HPLC)對從大鯢皮膚粘液中制備的活性糖肽進行分析,建立了較為理想的大鯢糖肽的HPLC分離體系,同時,對大鯢糖肽的抗氧化活性進行了測定。


          1 材料方法

          1.1材料、試劑、儀器

          大鯢糖肽,2009年9月由遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室提供,分子量≤4000,含糖量占27.6%(質量比)。
          甲醇、乙腈、三氟乙酸(TFA)為色譜純。
          P230高效液相色譜儀,UV230+紫外檢測器,SinoChromC18(5m,4.6mm×150mm)分析柱(大連依利特分析儀器有限公司)。

          1.2方法

          1.2.1色譜條件篩選將1rng大鯢糖肽溶解于lmL雙蒸水中,進行全波長掃描確定檢測波長。通過對流動相配比的順序優化法進行分離條件的選擇。

          1.2.2大鯢糖肽的·oH清除活力測定采用改進的2一脫氧核糖(2一Deoxy-D—ribose)氧化方法L4]測定OH清除活力。將5mmol/LFeSO4,5mmol/LEDTA和5mmol/L2-Deoxy—D—ribose各0.2mL,與0.2mL不同濃度的大鯢糖肽混合,加入0.10mL后,再加人0.2mL的5mmol/LH2O2,37℃保溫4h后,加入1.4TCA、0.5%TBA各1mL。反應混合物置于沸水浴中煮沸10rain。測定532nm處吸光值,抑制率按如下公式計算:抑制率

          式中:C為標準液的吸光度值;CB為空白液的吸光度值;S為樣品反應液的吸光度值;SB為對照液的吸光度值。


          2 結果

          2.1波長的選擇經全波長掃描,發現大鯢糖肽在280nm處有較強吸收峰,因此選定280nm作為檢測波長。

          2.2流動相的組成對分離效果的影響采用混合液設計順序優化實驗方案。利用具有確定組成的多元混合溶劑的多重選擇性,對一個分析任務進行分離條件的優化E。首先選擇3種具有確定組成的二元混合溶劑流動相,構成等邊三角形的3個頂點(圖1),各點混合溶劑的體積分數組成如下:


          圖1順序優化模型Fig.1Modelingfororderoptimizing
          A點,(0.1TFA)一100,B點,(乙腈):V(0.1TFA)一30:7O,C點,(甲醇):V(O.1TFA)一40:60。

          在A、B、C3種流動相中進行樣品分析,圖譜見圖2。

          圖2  A、B、C3點順序優化對應的HPLC圖譜
          Fig.2HPLCchromatogramofA,B,C
          如圖2所示,在A、B、C點流動相組成下,不能實現樣品組分的分離,因此可選擇三角形各邊上的中點(固定組成的三元混合溶劑)以及中心點(固定組成的四元混合溶劑)所對應的流動相,進行上述樣品分析。各點組成如下:
          D點,(乙腈):(0.1TFA)=15:85,
          E點,(甲醇):(0.1TFA)=20:80,
          F點,(乙腈):V(甲醇):V(0.1TFA)=15:20:65,
          G點,(乙腈):V(甲醇):V(0.1TFA)=10:13:77。

          圖3  D、E、F、G、H順序優化對應的圖譜
          Fig.3HPLCchromatogramofD,EIF,G,H


          由圖3可以看到,在D、E、F、G點流動相組成下,樣品組分不能完全分離。但通過7個點的圖譜分析,可以看出F、G兩點雖然沒有將樣品組分完全分離開,但其重合峰較少,并且樣品各組分都有顯現,因此應在兩點之間去尋求實現樣品組分完全分離的最佳混合溶劑的配比,經試驗確定,H點可獲較好的分離結果。
          H點的組成為:V(乙腈):V(甲醇):V(0.1TFA)=5:5:90。從圖3中可見,H點流動相組成下,大鯢糖肽中各成分已經達到了較好的分離效果。

          2.3流速對分離度的影響按已選定的檢測條件考察不同流速對樣品各組分分離效果的影響,結果表明:隨著流速的增大,樣品的保留時間逐漸縮小,分離度降低,柱壓升高;隨著流速減小,保留時間延長,分離度增大,但流速小于0.2mI/min時,保留時間過長,且色譜峰變寬。為縮短分離時間,且保留良好的分辨率,選擇流速為1.0mL/min。

          2.4大鯢糖肽的·OH清除活力測定各濃度大鯢糖肽的·OH的清除率結果如圖4。由圖4可知,在0.58~5.78μg/mL內,隨糖肽溶液濃度的增加,對羥自由基的清除率也隨之增加,當溶液中活性肽的濃度為5.78μug/mL時,對·0H的清除率達到62%。Yang等從高原蛙類的皮膚中提取了多個家族的抗氧化肽,確立了在兩棲動物中存在新的皮膚抗氧化系統。從大鯢皮膚黏液中制備的糖肽具有抗氧化活性,是兩棲動物中存在新皮膚抗氧化系統的補充證據。

          3 討論

          目前,有關活性多肽和蛋白質類藥物在臨床治療和制藥工業中的應用取得了快速發展,因此,建立一套完整的活性多肽分離純化技術具有重要意義。該試驗利用高效液相色譜,通過混合液順序優化方法,實現了大鯢糖肽的有效分離。與其他分離純化方法相比,高效液相色譜純化體系具有分辨率和回收率高、操作簡便、重復性好等優勢,可使用揮發性體系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)等作為流動相,純化產物不必脫鹽,大大簡化了操作步驟。雖然純化的蛋白質會發生變性,但通過HPLC能得到該蛋白的結構特征及疏水性等信息,并可將其精確地與其他蛋白相區分。甘一如等利用高效液相色譜法分離純化經化學合成的活性多肽藥物胸腺素α1。吳亞麗等對高效液相色譜法在降血壓肽分離與純化中的應用進行了研究,并對其分離條件進行了優化。肖向紅等建立了東北林蛙皮膚活性抗菌肽的高效液相色譜純化體系。兩棲動物皮膚分泌物中主要含有四大類生物化學成分,即生物胺、蟾蜍配基、生物堿、多肽與蛋白質。其中多肽的種類和數量特別豐富,因此,兩棲類生物又被稱為生物活性多肽資源的巨大貯存庫。當前有關兩棲動物皮膚黏液的研究有很多報道,但多集中于蛙類兩棲動物活性抗菌肽的研究,有關大鯢皮膚活性物質的研究未見報道。在此研究中,大鯢糖肽的體外抗氧化活性結果表明,大鯢皮膚活性糖肽具有清除羥自由基的作用,并且呈明顯的量效關系。這些結果既豐富了兩棲動物皮膚分泌物的研究,也為大鯢糖肽的利用提供了基礎數據。

           

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