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          科研成果

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          大鯢低聚糖肽對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

          摘 要:研究大鯢低聚糖肽(GSGPs)對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用。經腹腔注射CCl4制備小鼠急性肝損傷模型,分別灌胃三種不同濃度的GSGPs,以聯苯雙酯(200mg(/ kg·d))作為陽性對照。檢測血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉 氨酶(ALT)活性,肝組織中丙二醛(MDA)含量,超氧化物岐化酶(SOD)活性,觀察小鼠肝組織形態學變化。結果表明:GSGPs中(400mg(/ kg·d))、高(800mg(/ kg·d))劑量組可顯著抑制小鼠肝臟組織中由CCl4造成的血清中AST、ALT活性的升高,明顯降低肝組織MDA含量,并且提高肝組織中SOD活性。光鏡檢查結果表明,CCl4模型組肝細胞明顯腫脹變 形,肝細胞索紊亂,伴有炎癥細胞侵潤。GSGPs各劑量組的肝細胞索排列整齊、肝細胞排列規則,較模型組肝組織損傷明顯減輕。說明GSGPs具有保護CCl4急性肝損傷的作用。

          關鍵詞:大鯢,低聚糖肽,四氯化碳,急性肝損傷,保肝

          糖鏈是重要的信息分子,承載著很多重要的生物信息。糖鏈與蛋白質的相互作用使細胞具有專一識別性,并且能調控各種生命過程如:受精發生、生長、發育、分化、神經系統、免疫系統恒態的維持等,在炎癥及自身免疫疾病、老化、癌細胞異常增殖及轉移、病原體感染等過程中起重要作用。糖肽是糖修飾的蛋白片斷,具有很多生物活性和疾病密切相關。大鯢(Andrias davidianus),俗稱娃娃魚,屬有尾目、隱鰓鯢科,是體形最大的兩棲動物,也是我國特有的珍稀大型兩棲動物,屬國家二類保護動物。1999年,大鯢被農業部列為重點開發的養殖品種。目前,全國大鯢人工繁殖單位有100余個,年人工繁殖大鯢幼苗10余萬尾,且每年在快速遞增,2009年大鯢養殖量接近200萬尾。對大鯢深加工產品的研究,均是宰殺大鯢后提取皮、肉、骨來利用,這樣對大鯢資源的保護非常不利。另一方面,大鯢體表多皮膚腺,在生長過程中不斷分泌黏液,如果能夠對大鯢體表黏液進行開發利用,可以起到既利用大鯢資源,又不危害大鯢的生長繁殖的作用,是實現大鯢資源可持續利用的最理想狀態。大鯢黏液經酶解制備的大鯢低聚糖肽(GSGPs)存在O-連接糖苷鍵,具有抗氧化、提高免疫、抗疲勞、抗紫外等生物學活性,本文研究了大鯢GSGPs對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用,以期為大鯢黏液的利用以及大鯢產業化提供基礎理論依據。

           

          1 材料與方法
           
          1.1 材料與儀器
          GSGPs 遼寧省水產品加工及綜合利用重點實 驗室制備;清潔級昆明種小鼠(體質量18~22g,雌雄 各半) 大連醫科大學實驗動物研究中心[SCXK(遼) 2008-0002];聯苯雙酯(DDB,批號100505) 浙江醫 藥有限制造公司;谷丙氨酸轉移酶(ALT/GPT)測定 試劑盒(批號20110608)、谷草氨酸轉移酶(AST/GOT) 測定試劑盒(批號20110613)、丙二醛(MDA)測定試 劑盒(批號20110613)、超氧化物岐化酶(SOD)測定 試劑盒(批號20110613)、考馬斯亮藍蛋白測定試劑 盒(批號20110607) 南京建成生物工程公司。 熒光顯微鏡 雷勃公司;BS110S型分析天平 北 京賽多利斯儀器系統有限公司;UV-754型紫外可見分 光光度計 上海第三分析儀器廠;IEC型微量臺式小 型離心機 德國制造;GL-21M型高速冷凍離心機 長 沙湘儀離心機。
          1.2 實驗方法
          1.2.1 肝損傷小鼠及給藥 選昆明種小鼠48只,隨機分成對照對照組、模型對照組和聯苯雙酯陽性對照組 [200mg/(kg·d)],GSGP濃度按照羊棲菜水溶性多糖保 肝活性研究中的劑量,分為低濃度[200mg/(kg·d)]、 中濃度[400mg/(kg·d)]、高濃度[800mg/(kg·d)]劑量 組,每組8只,于12h黑暗、12h光亮的塑料飼養箱內飼 養,室溫(20±2)℃,濕度40%~60%,自由采食和飲水。 各給藥組每天灌胃1次,連續7d。對照組和模型組給 予同樣量的生理鹽水,于末次給藥2h后,對照對照組 按10μL/g的標準腹腔注射植物油,其余每組均按 10μL/mg標準腹腔注射0.2% CCl4植物油溶液。禁食 20h后,斷頭取血,在30min內,3500r/min,離心5min后 得上層血清備用。 快速處死小鼠取肝臟,并在肝左葉組織取約0.3g 放冰冷的生理鹽水中漂洗,取出后用濾紙將水吸干, 制成10%肝組織勻漿液(生理鹽水的體積總量是組 織塊體積的9倍),制備好的10%的肝組織勻漿液在 低溫低速離心機中以2000r/min左右離心10~15min, 將離心好的勻漿保留上清液棄沉淀待測。
          1.2.2 生化指標檢測與病理學觀察 血清中谷草轉 氨酶(AST)與谷丙轉氨酶(ALT)活性,肝臟組織中丙 二醛(MDA)含量,超氧化物岐化酶(SOD)活性以及 肝組織中蛋白含量均按試劑盒的要求進行測定。處 死小鼠后,取肝臟右葉組織約0.3g,用10%的中性甲 醛溶液進行固定,石蠟包埋切片。蘇木精-伊紅(HE) 染色,在顯微鏡下進行病理學觀察。
          1.2.3 統計學處理 用SPSS統計軟件對實驗數據進 行處理,數值以x±s表示。
           
          2 結果與討論
           
          2.1 GSGPs對CCl4致肝損傷小鼠的生化指標影響 GSGPs對CCl4致肝損傷小鼠生化指標影響的實 驗結果如表1所示,腹腔注射CCl4可引起小鼠急性 肝損傷,模型組血清ALT、AST活性明顯高于對照組 (p<0.01),表明造模成功。GSGPs各劑量組ALT、AST 的含量顯著低于模型組(p<0.01),中、高劑量組的 GSGPs可顯著抑制由CCl4造成的血清ALT、AST活性 升高。 CCl4經肝臟細胞內質網代謝,導致自由基增加, 影響生物結構或通過氧激活產生的三線態氧,對肝 臟產生損傷作用。CCl4肝損傷模型是典型的急性 肝損傷模型:CCl4經過肝微粒體細胞色素P450酶激 活,生成CCl3 ·,CCl3 ·與氧作用,形成具有更強活性的 CCl3COO·自由基,更為嚴重的在CCl3 ·啟動的過氧化 自由基的連鎖反應中,還可產生超氧陰離子(O2 - ·)和 羥陰離子(OH·)自由基,這些自由基更為嚴重的損 傷肝細胞各組分。谷丙轉氨酶(ALT)與谷草轉氨酶 (AST)是肝功能的重要指標,ALT與AST分別存在于 肝細胞漿以及肝細胞漿的線粒體中。肝細胞損傷時, 致使肝臟腫脹,ALT進入血中,當肝細胞嚴重損傷危 及至線粒體,AST也進入血中。CCl4急性肝損傷導致 血清ALT、AST活性明顯升高。只要有1%的肝細胞壞 死,就可以使血清酶增高一倍,是檢測肝細胞受損的 靈敏指標。自由基與肝細胞內的蛋白等進行結合,干 擾蛋白質合成,與細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂 質過氧化反應以及氯烷化作用。初期引起肝臟膜性 損傷,使肝細胞膜的功能缺失,嚴重可導致肝細胞壞 死。實驗結果表明GSGPs對由CCl4誘導的小鼠急性肝 損傷具有保護作用。 CCl4模型組造成小鼠機體的MDA含量比對照組 顯著升高(p<0.01),而GSGPs各劑量組MDA含量顯著 低于模型組(p<0.01),高劑量組的MDA含量低于對 照組。說明灌胃GSGPs可以減少小鼠血清中氧化產 物MDA產量。模型組SOD活性與對照對照組相比顯 著降低(p<0.01),而GSGPs中高劑量組的SOD含量顯 著高于模型組和對照組(p<0.01),說明灌胃GSGPs能 夠提高小鼠肝組織中SOD活性。GSGPs高低劑量組小 鼠體內MDA含量顯著降低,SOD活性顯著升高。CCl4 急性肝損傷會同時導致超氧化物歧化酶(SOD)、谷 胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX )和谷胱甘肽(GSH)消耗 增加,使模型組SOD、GSH-PX活性和GSH含量明顯降 低。文獻表明肝臟炎癥、免疫損傷以及癌變等肝損 傷,致使肝組織內SOD含量減少,血清中脂質過氧化 產物(MDA)含量增加。GSGPs各劑量組均表現出對 由CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。
          2.2 GSGPs對CCl4處理小鼠肝組織學影響 正常組織肝小葉結構清晰,肝細胞索狀排列規 則,肝細胞結構及形態正常。CCl4模型組肝細胞明顯 腫脹變形,肝細胞索紊亂,伴有炎癥細胞侵潤,造成 不同程度的功能退化,肝動脈的纖維化以及主血管 的擴張以及阻塞。GSGPs低、中、高劑量組的肝細胞 索排列整齊,肝細胞排列規則,較模型組損傷明顯減 輕。光鏡結果顯示,GSGPs能明顯減輕CCl4對肝組織 的急性損傷。
          臨床上使用糖肽類中藥結合保肝護肝類西藥結 合的方法,防治炎癥性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、肝 癌等肝病取得了良好的效果。糖肽護肝功能可以從 三個方面進行解釋。一是糖肽能夠有效清除自由基, 防止自由基對肝細胞進行攻擊,使肝細胞發生脂質 過氧化,達到對肝損害保護的目的,這樣的生物活性 物質有牛筋草提取物、羊棲菜糖蛋白、蘆薈多 糖、桐棉葉提取物。二是糖肽等提取物能夠改善 肝損傷實驗小鼠模型的生理生化指標,例如復方枸 杞提取物改善肝損傷小鼠的肝臟組織狀態,提高血 清中SOD,降低血清中ALT、AST,降低血清中總膽固 醇(TC)、甘油三酯(TG)指標,抑制細胞色素酶P450 活性,阻斷自由基的產生,減輕由于過氧化而引起的 肝細胞膜、線粒體、溶酶體損傷導致的肝細胞壞死, 降低轉氨酶,達到減輕肝損傷的效果。三是糖肽能夠 促進免疫細胞DNA的合成,增強免疫應答,明顯增殖 脾細胞及T細胞,有效提高機體免疫功能,如薄芝糖 肽聯合干擾素治療慢性乙型肝炎具有明顯療效,且 副反應少。
           
          3 結論
           
          本研究利用CCl4導致小鼠急性肝損傷模型,研究 了GSGPs對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護作用。結果 表明,GSGPs中(400mg/(kg·d))、高(800mg/(kg·d)) 劑量組可顯著抑制小鼠肝臟組織中由CCl4造成的血 清中AST、ALT活性升高,明顯降低肝組織MDA含量, 并且提高肝組織中SOD活性。同時,GSGPs各劑量組 的肝細胞索排列整齊、肝細胞排列規則,較模型組肝 組織損傷明顯減輕。本研究表明,GSGPs具有減輕 CCl4對肝組織的急性損傷的作用。研究結果為更好 地開發利用GSGPs提供了一些基礎數據。
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