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          科研成果

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          大鯢低聚糖肽性質初步研究

          摘 要:采用化學方法對大鯢低聚糖肽的氨基酸組成、糖組成及糖肽連接方式進行了初步研究。結果表明,大鯢低聚糖肽含蛋白量為 80.01%總糖含量為 15.15% 。其含有的氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及唾液酸分別為3.39% 、0.65% 、2.45% 和 0.60% 。其氨基酸組成中,蘇氨酸的含量最高,達 13.1% ,其次是脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、苯丙酸等。大鯢低聚糖肽的 β-消旋反應和血凝集反應,表明大鯢低聚糖肽中糖肽鍵以 O-連接的形式存在。

          關鍵詞:大鯢低聚糖肽,氨基酸組成,糖組成,β-消旋反應

          大鯢( Andrias davidianus) 是現存個體最大的兩棲動物,屬國家二類保護動物。在我國廣泛分布,主要產于長江、黃河及珠江中上游支流的山溪河流中,尤以四川、湖北、湖南、貴州、陜西等省為多。大鯢營養價值高,含有優質蛋白質和豐富的氨基酸、微量元素。其機體中含有 50 多種天然生物活性物。這些生物活性物在食用、藥物、化妝品、健康食品等方面具有獨特的研發價值。本實驗室從大鯢體表黏液中制備出大鯢低聚糖肽,通過小鼠抗疲勞實驗,發現其具有抗疲勞功能。大鯢低聚糖肽還具有良好的吸濕性和較強的抗紫外線活性。本文對大鯢低聚糖肽的氨基酸組成、糖組成及糖肽連接方式進行了初步研究,以期為以后研究大鯢低聚糖肽活性提供基礎數據。

          1 材料與方法
          1.1 實驗材料
          大鯢低聚糖肽 2010 年 11 月由遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室制備; 咔唑、無水乙醇、四硼酸鈉、間羥基聯苯、乙酰丙酮、對-二甲基苯甲醛、無醛乙醇、間苯二酚、硫酸銅、乙酸丁酯-丁醇( 體積比 4∶1) 、鹽酸、濃硫酸等試劑 均為國產分析純。
          1.2 實驗方法
          1.2.1 大鯢低聚糖肽基本組成測定 準確稱取 0.5g大鯢低聚糖肽,于 100mL 容量瓶中定容,制得大鯢低聚糖肽溶液,備用。
          1.2.1.1 蛋白含量測定 采用 Follin-酚法。取大鯢低聚糖肽溶液 20μL,置于干凈的試管內,加 5mLFollin 甲液,置于 25℃ 水浴中 10min 后,加入 0.5mLFollin 試劑乙,繼續水浴 30min,于 500nm 處測量吸光值。
          1.2.1.2 糖含量測定 采用苯酚-硫酸法。取 0.1mL大鯢低聚糖肽溶液,加入 1mL 6% 苯酚溶液后,加 5mLH2 SO4,靜置 20min,于 490nm 處測量吸光值。
          1.2.1.3 鹽酸氨基葡萄糖含量測定 采用乙酰丙酮法。取大鯢低聚糖肽溶液 0.5mL,置于干燥的具塞比色管中,加水至 5.0mL,然后加 1.0mL 乙酰丙酮溶液,搖 勻,于沸水浴中加熱 25min,取 出,冷 卻。加對-二甲基苯甲醛溶液 1.0mL,搖勻,60℃ 水浴 1h,放置冷卻,于 525nm 處測量吸光值。
          1.2.1.4 半乳糖醛酸含量測定 采用硫酸咔唑法。取大鯢低聚糖肽溶液 1.0mL,置于干燥的具塞比色管中,冰水浴中加入四硼酸鈉- 硫酸溶液 5.0mL,混勻后,沸水浴加熱 20min,取出后立即冷卻至室溫,加0.15% 咔唑溶液 0.2mL,搖勻,在室溫下保持 2h,在530nm 處測量吸光值。
          1.2.1.5 葡萄糖醛酸含量 采用間羥聯苯法。取大鯢低聚糖肽溶液 0.5mL,加入試管中,置冰水浴中,加入 4.5mL 四硼酸鈉-硫酸溶液,繼續冷卻,充分振蕩,將試管置于沸水浴中加熱 10min,立即放入冰水浴中冷卻,加入 0.05mL 0.15% 間羥基聯苯溶液,充分振蕩,靜置 20min,在 525nm 處測量吸光值。
          1.2.1.6 唾液酸含量測定 采用間苯二酚法。取大鯢低聚糖肽溶液 1.0mL,置于干凈的試管內,加間苯二酚 - 鹽 酸 溶 液 ( 分 別 量 取 2% 間 苯 二 酚 溶 液2.5mL,0.1mol /L 硫酸銅溶液 62.5μL,25% 鹽酸溶液20mL,加水稀釋至 25mL,混勻。實驗前 4h 內配制)1mL,沸水浴 30min,取出置冰浴 3min,加乙酸丁酯-丁醇液( 乙酸丁酯-丁醇的體積比 4∶1) 2mL,充分混勻,室溫放置 10min,在 580nm 處測量吸光值。
          1.2.2 大鯢低聚糖肽氨基酸組成分析 將大鯢低聚糖肽干燥至恒重,取一定量樣品在 6mol /L 鹽酸中,在 110℃條件下消化 24h,脫酸后,用水定容至 5mL,在氨基酸自動分析儀上測定樣品中氨基酸的組成。
          1.2.3 β-消旋反應測定糖肽鍵連接方式 準確稱取大鯢低聚糖肽樣品 5mg,溶于 3mL 蒸餾水中,然后將樣品 溶 液 分 成 兩 等 份,各 1.5mL。其 中 一 份 加 入1.5mL 蒸餾水; 另一份加入 1.5mL 0.4mol /L NaOH 溶液,反應2h 后,兩份溶液分別在200~400nm 范圍內進行紫外光譜掃描,得到 β-消除反應前后紫外掃描圖。
          1.2.4 血細胞凝集法測定糖肽鍵連接方式 采用專一性識別-Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser/Thr 結構的凝集素( CAL,海綿凝集素) ,進行三組 B 型血紅細胞凝集實驗。第一組在血紅細胞懸液中加入凝集素; 第二組血紅細胞懸液; 第三組在血紅細胞懸液中加入凝集素和大鯢低聚糖肽。室溫孵育 30min 后顯微鏡下觀察血紅細胞凝集現象。1.2.5 紅外光譜測定 取一定量的大鯢低聚糖肽干粉與 KBr 混合壓片,在 400~4000cm- 1范圍內進行紅外光譜掃描。
           
          2 結果與分析
          2.1 大鯢低聚糖肽基本組成分析
          經化學分析方法測定大鯢低聚糖肽的基本組分,結 果 見 表 1。大鯢低聚糖肽中總糖含 量 為15.15% ,總蛋白含量為 80.01% 。其中鹽酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和唾液酸含量分別3.39% 、0.65% 、2.45% 和 0.60% 。葡萄糖醛酸具有抗腫瘤、抗凝血、增強機體免疫力的作用,是刺參酸性粘多糖的主要成分。唾液酸具有提高人體免疫力、抗癡呆、提高記憶力和智力的作用,是燕窩的主要功能成分。因此,組成大鯢低聚糖肽的糖成分對人體具有保健功能。
          大鯢低聚糖肽的氨基酸組成見表 2。由表 2 可知,大鯢低聚糖肽中所含的 18 種氨基酸中除色氨酸未測出外,人體其它 7 種必需氨基酸( 蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸)和組氨酸( 嬰兒所必需的氨基酸) 的含量均較高。其中必需氨基酸中蘇氨酸含量最為豐富,高達 13.1% 。其次是天冬氨酸/酰胺( Asx) 和谷氨酸/酰胺( Glx) 分別為 11.2% 和 12.5% 。而絲氨酸含量最低為 0.2% 。精氨酸為人體半必需氨基酸,有良好的降血壓作用。苯丙氨酸是人體內腎上腺素、甲狀腺和黑色素合成的原料。組氨酸對嬰幼兒也屬于必需氨基酸,在新生兒及兒童生長發育期起著非常重要的作用。它具有抗潰瘍和促進細胞再生的作用,幼兒缺乏組氨酸將導致貧血。由此可見,大鯢低聚糖肽具有潛在的多種保健功能。
          2.2 大鯢低聚糖肽鍵特征分析β-消旋反應是一種鑒定糖肽鍵中是否存在 O-連接糖肽鍵的常用方法,O-連接糖肽鍵在堿作用下很容易斷裂。糖肽鍵在用堿處理時,與 O-糖肽鍵連接的絲氨酸生成 α-氨基丙烯酸,蘇氨酸生成 α-氨基丁烯酸,這種不飽和氨基酸的形成,在 240nm 波長處紫外吸收增強。其 β-消旋反應前后大鯢低聚糖肽的紫外吸收圖譜如圖 1。由圖 1 可見,在 240nm處 β-消旋反應后大鯢低聚糖肽的紫外吸收顯著增強,說明大鯢低聚糖肽中存在 O-連接糖肽鍵。
          從圖 2-A 可以看出,在血紅細胞中加 CAL,血紅細胞出現凝集現象。因為血細胞表面受體與凝集素結合。圖 2-B 為對照組,血紅細胞未發生凝集現象。圖 2-C 為在血紅細胞中加 CAL,同時加入大鯢低聚糖肽,可以看出血紅細胞未發生凝集現象。這是因為大鯢低聚糖肽與凝集素結合,阻礙了凝集素與血紅細胞表面受體的結合。這從另一方面證明了大鯢低聚糖肽中存在 O-連接糖肽鍵。
          2.3 大鯢低聚糖肽紅外光譜分析
          從大鯢低聚糖肽紅外光譜看 ( 圖 3 ) ,3275.2、1653.3、1454.9cm- 1顯示結構中存在酰胺官能團;3063.8cm- 1顯示有咪唑環官能團; 2962.3、1402.3cm- 1為羥基特征峰。紅外光譜圖反映了蛋白質結構中的肽鍵、咪唑環以及糖鏈上的羥基。

          3 結論
          對大鯢低聚糖肽含有的氨基酸進行了研究,發現它的氨基酸種類較豐富,其中必需氨基酸中蘇氨酸含量最為豐富。對它的糖組成進行的研究表明,它的糖成分基本組成為氨基糖、酸性糖以及中性糖等。同時,發現大鯢低聚糖肽中存在 O- 連接糖肽鍵。具有 O- 連接糖肽鍵的糖肽,往往具有免疫活性,因此大鯢低聚糖肽在保健食品開發方面具有重要價值。

           

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